以萨摩藩力量为后盾和基础，大久保逐渐活跃于中央政界，其立场有一个从公武合体派转向割据倒幕派的过程。他和久光最初的目标是，反对幕府策划的将孝明天皇的妹妹和宫下嫁给幕府将军德川家茂作夫人，进谏天皇敕命德川庆喜为将军监护，让越前藩主松平庆永就任大老，由萨摩藩兵任京都的警卫等等。1862年，岛津久光和大久保率萨摩藩兵一千人进京，向朝廷施加压力，这样的军事行动在德川幕府时代尚未有过。
他们深知尊王攘夷激进派有马新七等人准备乘久光进京之际举义，袭击佐幕派公卿，便断然派萨摩藩兵杀死有马等人，这就是有名的“寺田屋事件”。从中可见，大久保为了达其目的，不惜向早年的政治伙伴开刀的冷酷手段。这个事件造成了公武合体派和尊王攘夷派的完全决裂，当然也加速了公武合体运动的进程，朝廷颁布敕命：任命庆喜为将军监护，松平庆永任政事总裁，并宣布要改革幕政。公武合体获得成功，大久保的名声也在中央及各藩传播开来。
但另一方面，尊王攘夷运动也得到很大发展，岩仓具视被视为朝贼而赶下台去，长州、土佐等尊攘派力量的高涨抵消了久光等公武合体派的成功。大久保继续奔走在京都政界。
由于1862年发生了萨摩藩武士砍杀了英国人的“生麦事件”，萨摩与英国人的冲突尖锐化，英国要求赔偿，并惩办肇事者，被久光拒绝，最后酿成了1863年的“萨英战争”。英国舰队进攻鹿儿岛，萨摩军民进行了顽强抵抗，大久保是战争指挥官，最后因兵力悬殊，萨摩的鹿儿岛被炮火破坏很重。这场战争使大久保对近代战争有了亲身体验，为其以后的军事活动提供了经验。萨英战争之后，大久保设法从幕府借来赔款交付英国，又通过谈判加强了同英国的联系合作，加速了萨摩藩开国的步伐。
孝明天皇是一个顽固派，他密敕久光率兵进京镇压尊攘派。大久保等人乘机与镇守京都的松平容保联合，于1863年9月30日（文久三年八月十八日）发动军事政变，将尊攘志士以及尊攘公卿三条实美等七人逐出京都。不久，久光、大久保再次率兵进京，控制中央政局。1864年初，作为公武合体运动的结晶的雄藩会议筹备就绪，设置了以德川庆喜、松平庆永、松平永保、山内容堂、伊城宗达和岛津久光等六人组成的“参与议会”，在天皇的主持下讨论国政方针。然而，公武合体运动是违背日本历史发展潮流的，各雄藩各有私心，政见不同，内部极不统一，而德川庆喜则竭力让幕府独揽领导权。不到三个月，六个“参与”都辞职了。
这个公武合体派的“临时政权”的垮台，使大久保十分震动，也对幕府的倒行逆施深感失望。他回藩后致力于藩政改革，继续加强同英国的合作，令藩士村田经芳研制出“村田步枪”，又于1865年派五代友厚等15人去英国。这时，日本政局更加险恶，长州尊攘派发动“禁门之变”，被萨摩、会津的联军击败，幕府进而征讨长州。翌年初，高杉晋作等人在下关举兵，获得成功，实行倒幕割据政策。长州还通过萨摩向英国购买武器，逐渐改善了两藩之间的关系。这种时局的发展，使大久保逐渐变成倒幕派，逐渐从公武合体的头面人物转变成割据倒幕的领导人之一。
从1866年到第二年底，大久保在京都住了一年半，以全部力量投入讨幕活动，他和蛰居在家的岩仓具视取得联系，并派人保护他，以免被讨幕过激派杀害。经过坂本龙马、中冈慎太郎等人斡旋，萨长两藩于1866年2月缔结了倒幕同盟。幕府发动第二次征讨长州的战争，遭受萨摩抵制，萨摩与德川庆喜的友好关系从此中断。幕府征长失败，将军家茂病死（庆喜继任将军），使幕府进一步陷入深刻危机。
1867年初，朝廷召集的萨、土、越前和宇多岛藩四藩藩主在京都会谈，很快就归于失败，形势进一步朝着武装讨幕的方向发展。不久，岩仓回到京都，与大久保一起成了倒幕的旗手。大久保先后与长州的木户孝允、广泽真臣，艺州的辻将曹等讨论出兵讨幕的问题。大久保还和西乡联合写信给岩仓具视：“二百余年太平旧习污染了人心，一旦动起干戈，反使天下耳目一新，中原弥定，构成盛举。”
德川庆喜面对不利局势，以退为攻，率先“奉还大政”，以消除讨幕口实，想凭借巨大领地和兵力，继续凌驾于诸侯之上。但讨幕派并没有被迷惑，他们在筹备武力讨幕的同时，积极准备后于1868年1月3日成功地发动了宫廷政变。紧接着在戊辰战争中大久保担任参谋，以后又任总裁局顾问处理内务，协助西乡等人指挥作战，从而建立和巩固了明治新政权。
